1506達芬奇受法國統治者Charles d'Amboise的徵召再次回到米蘭為其宮廷效命，然而同時佛羅倫斯的市議會也不斷催促達芬奇回到佛羅倫斯完成《安加裡》壁畫。最後在法國駐佛羅倫斯大使的介入之下，達芬奇得以留在米蘭並且受命成為法國國王路易十二世的宮廷畫師。達芬奇首先為了解決與聖母無原罪胎始兄弟會的畫作紛爭而畫了第二幅《巖窟聖母》，並且在法國國王的要求下重拾佛羅倫斯曾經創作的題材《聖母子與聖安娜》。

1507-08年達芬奇以炭筆、白堊粉筆在有色的厚紙板上創作了一幅《聖母子、聖安娜和施洗者約翰》(又名《伯靈頓學院大型草圖[58]》）。內容與佛羅倫斯1501年的草圖類似，只是此處以年幼的施洗約翰取代了羔羊。這實際上是結合了兩個十五世紀佛羅倫斯的流行題材：《聖母子和施洗約翰》以及《聖母子與聖安娜》（聖安娜為瑪利亞的母親，也是佛羅倫斯的守護聖人之一）。因此，畫中表現了四個人物之間從外形到內心的緊密互動。

四個人物眼神的交錯凝視，形成一個優美的流線和內聚的構圖：聖安娜慈祥地望著女兒瑪利亞，而瑪利望著兩個孩子，聖嬰對著約翰，而小約翰也忠誠地回望著耶穌。為了形成緊密的整體，達芬奇讓人物交疊著，聖母（別紐地）半坐在聖安娜的腿上，使得兩人幾乎合為一體。

瑪利亞手中的聖嬰好像知道自己的使命，幾乎掙脫母親的懷抱，努力向前，舉著小手賜福給約翰─將來為他舖平傳道之路的人。聖安娜的手勢（僅有粗略的輪廓）令人想起《最後的晚餐》中的湯瑪斯同樣手指青天，暗喻了「上帝」的意思。目睹了兩個孩子的互動，安娜會心微笑，手指上天彷彿在向瑪利亞說：「一切都是神的安排。」這個「微笑」再次傳達了不可言喻的奧秘 ─ 安娜領悟了他人難以參透的天機，就像佛祖拈花，大迦葉心領神會的微笑一般。

而聖母的神情雖然詳和溫柔，微笑中卻帶著些許憂鬱。她預知了孩子的未來的命運，卻只能被動地抱著急欲和約翰履行義務關係的聖嬰。達芬奇畫過不少聖母子的題材，對於嬰孩作過充分的觀察和速寫。他在筆記本中提到過：「畫小孩坐著的時候，應該是活潑而不停扭動的。」所以達芬奇所有的《聖母子》題材中，聖嬰都是動態、不安分的。在此聖嬰「賜福」的動作更是把兒童的天性溶入在宗教的寓意中。

《聖母子、聖安娜和施洗者約翰》(又名《伯靈頓學院[58]大型草圖》)1507 ~ 1508 年；炭筆·粉筆·畫紙，141.5 x 106 公分；國家畫廊，倫敦，英國。
Madonna and Child with St Anne and the Young St John； 1507-08；Charcoal with white chalk heightening on paper, 141,5 x 106 cm;National Gallery, London ）

由於草圖上沒有打洞的痕跡，表示此初稿尚未進行騰寫至畫板上的階段。至於未完成的原因也引起眾多猜測。達芬奇在猶豫什麼？遇到了構思上的困難嗎？被其它研究分心了嗎？我們不得而知。

（1986年，一個狂徒對著這幅草圖射擊，造成了瑪利亞胸口的一些損壞，修復者因而有機會檢視了紙板，發現厚紙板是由8層紙合成的。此作是倫敦國家畫廊收藏的最脆弱的作品之一，被特別懸掛在特別建造的保護在特別遮光的小房間內；以防白粉筆和炭筆受光太強而褪色。）

稍後法國國王路易十二委託達芬奇將《聖安娜》草圖再修改畫成油畫，因為法國國王的第二任妻子名叫安娜。因此達芬奇於1508年開始著手《聖母子和聖安娜》的油畫，可惜這件作品一直到他臨終時尚未全部完成，目前收藏於盧浮宮。

《聖母子與聖安娜》
The Virgin and Child with St Anne c. 1510 Oil on wood, 168 x 130 cm; Mus□e du Louvre, Paris

這幅《聖母子、聖安娜和施洗約翰》油畫，構思和前述《伯靈頓學院大型草圖》相近，但題材上更接近達芬奇1501年在佛羅倫斯繪製的那一幅，因為達芬奇以羔羊代替了施洗約翰的位置。

圖中人物的安排更加集中，形成一個以安娜為頂點的三角形構圖。為了達到這個結構，達芬奇甚至讓瑪利亞不合常理的疊坐在安娜腿上，使二人緊密結合成的重心有力的凝聚了畫面，平衡著畫面聚、散兩種力量─ 左邊的聖安娜、瑪利亞和右邊的聖嬰和羔羊。人物的安排十分特別：安娜懷中坐著瑪利亞，而瑪利亞向前欲意抱回聖嬰，聖嬰則緊抓著象徵犧牲的羔羊：四個人物成串似的一個抱著一個，而其中卻包含了嚴肅的宗教意涵和複雜的人類情感。抱著羔羊的年幼耶穌儼然已經義無反顧地選擇了為人受難的未來；身體前傾意欲拉回孩子的瑪利亞表現出作為慈母的人性，似乎不忍孩子犧牲的命運而意圖阻止。聖安娜安詳而超然地望著眼前的景象，她的容貌令人想起蒙娜麗莎，臉上微笑卻是歡喜而慈悲的。

從聖母的衣袍和手部的簡略來看，作品顯然尚未完成。背景仍然採用了空氣遠近法，除了右後方的一棵樹之外，達芬奇嘗試以單純化的素材─山巖結構和水流─來營造背景空間，結果造就了一個變化豐富、層次分明、山川氤氳的世界（只是略顯荒涼），乍看之下頗像中國山水畫。

不論這幅《聖安娜》油畫，還是前述的《伯靈頓草圖》，都間接印證了1501年的佛羅倫斯草圖引起的轟動是有道理的。

在米蘭的這段時間，達芬奇也結識了兩個對他影響深遠的年輕人，一是為達芬奇的解剖研究開啟了新方向的帕維亞大學解剖學教授托爾（Marcantonio della Torre）；一個是房東兒子也是年輕畫家的梅濟（Francesco Melzi），後來成為達芬奇的入室弟子，並在他晚年如親人般照顧他，繼承了他的大量手稿。

達芬奇在1511年受米蘭傭兵吉安．特裡夫吉歐[59]（Gian G.Trivulzio）之托製作一座騎馬雕像。不過這件作品又因為1512年米蘭遭瑞士、西班牙、威尼斯和教皇國組成的聯軍攻入而無法繼續。法國人被逐的同時，達芬奇也失去了僱主。而已經六十歲的達芬奇，極需要一個安定的生活和穩定的收入。1513年達芬奇受教皇邀請，一行人離開米蘭前往羅馬。

註解：

[58] 作品曾經收藏在伯靈頓學院。由於經費不足，學院曾經在1962年有意以80萬英鎊賣出草圖。然而，政府怕流落外人手中，便將作品在倫敦國家畫廊展出，盛況 空前，四個月中就有25萬人參觀。許多人自發捐款，希望將它保留在英國。最後國家藝術收藏基金會幫助之下如願以償。

1986年，一個狂徒對著這幅草圖射擊，造成了瑪利亞胸口的一些損壞，修復者因而有機會檢視了紙板，發現厚紙板是由8層紙合成的。此作是倫敦國家畫廊收藏的最脆弱的作品之一，被特別懸掛在特別建造的保護在特別遮光的小房間內；以防白粉筆和炭筆受光太強而褪色。

[59] 原來是握有軍權的米蘭貴族，後來倒戈擁護法王路易十二為米蘭的統治者。